微量m6A测序揭开共转录逆向调控组蛋白修饰机制 | m6A专题

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冬日凌冽，寒风肆意拍打着窗户，站着窗边的小编陷入了沉思。许久过后，小编走到了工位上，伸出冰冷的双手开始疯狂码字，只为给许久未见的各位送上一篇暖文。本文虽没有青春小说里那些甜甜的恋爱情节，但其内涵绝对会让各位未来的m6A高分文章新星们磕得停不下来。好了，废话不多说，接下来跟小编一起遨游知识的海洋吧~（注意！文末高能预警！有彩蛋！各位不要错过哦，答应我，一定要看到最后呀~）

2020年8月10日，夏来新/肖姗团队合作的题为“N6-Methyladenosine co-transcriptionally directs the demethylation of histone H3K9me2”的文章发表在Nature Genetics上，揭示了m6A与组蛋白去甲基化修饰之间的关系。

文章题目：m6A共转录调控组蛋白H3K9me2的去甲基化

期刊：Nature Genetics

影响因子：38.330

刊登日期：2020年8月10日

研究机构：南方医科大学夏来新/肖姗课题组等

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1. m6A与组蛋白修饰相关

为了研究m6A与组蛋白修饰之间的关系，作者构建了一个染色质修饰报告系统，分为Ctrl报告系统和m6A报告系统。相对于Ctrl来说，m6A报告系统存在经典的m6A motif 序列GGACW, W代表的是A或U碱基（图a,b），而另一个报告系统则为突变（即GGACH这个结构中A被破坏掉了）。作者使用这个系统，检测了多个组蛋白的表达水平，发现在m6A报告系统中，组蛋白H3K9me2的表达水平显著下调（图c）。并且，在敲除m6A甲基化转移酶METTL3后，m6A报告系统中的H3K9me2表达水平与Ctrl组基本保持一致（图e）。以上结果说明，H3K9me2组蛋白修饰与m6A有关。

由于小鼠的胚胎干细胞ESC本身数量稀少，并且还要检测这些ESC中的新生RNA（nascent RNA），只能采取微量m6A测序（low Input m6A-seq）（这篇何川教授作为编辑/审稿人的微量m6A测序方法学究竟有哪些玄机? | m6A专题）的方法对组蛋白修饰相关RNA的m6A位点进行全景图谱绘制与分析。

与上面的报告系统相一致的是，H3K9me2的分布（而非其他组蛋白修饰）与m6A位点高度重合一致，且motif也是相吻合的，均为GGAC。

此外与含H3K9me2的mRNA相比，不含H3K9me2的染色质所产生的RNA在m6A测序中高度富集。

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2. m6A是维持H3K9me2稳态的关键因素

作者进一步想要了解m6A是否是维持H3K9me2稳态所必须的，故在小鼠胚胎干细胞中（mES cells）分别突变了甲基化转移酶METTL3、METTL14以及去甲基化酶FTO（图a，b，c），来观察m6A对H3K9me2稳态的影响。通过WB实验结果可知，与野生型细胞相比，在METTL3–/– 和METTL3D395A 的细胞中，H3K9me2蛋白的表达显著增加（图d）。随后，作者使用野生型和METTL3D395A 细胞做了H3K9me2的ChIP测序，从测序的热图结果来看，在突变掉METTL3后，与H3K9me2相关的大部分基因的表达水平上调（图e）。其中，3378个上调基因与带m6A修饰的基因有重叠（图f）。

此外，METTL3D395A 细胞与野生型细胞相比，带m6A修饰的基因区域的H3K9me2表达显著高于不带m6A修饰的区域（图g）。以上结果表明，METTL3的催化活性在维持H3K9me2稳态上扮演着不可或缺的角色。

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3. m6A与H3K9me2去甲基化酶KDM3B的定位相关

KDM3A/B/C是组蛋白H3K9me2的去甲基化酶，作者使用HPM（Human Proteome Map）数据库发现，KDM3B与METTL3、METTL14有强相关性(图a)。通过KDM3B的ChIP测序结果以及m6A测序结果可知，有5976个（约70.5%）与KDM3B相关的基因和带m6A修饰的基因重叠（图b）。并且，KDM3B在m6A peak峰和METTL3 peak峰的中心有显著富集（图c，d）。另外，METTL3 peak峰的信号强度与KDM3B的信号强度呈正相关（图e）。以上结果揭示了m6A位点与KDM3B定位之间存在密切关联。

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4. m6A通过调控KDM3B靶向目标染色质从而导致H3K9me2去甲基化

作者猜想m6A可能通过共转录调控KDM3B来实现其目标染色质定位。于是，作者做了一系列的实验来验证了这一想法。首先，作者探究了KDM3B与RNA聚合酶II（Pol II）之间的关系，发现在Pol II peak峰处，KDM3B有显著富集（图a），用Pol II抑制剂DRB抑制Pol II的活性后，KDM3B的表达量有所下降（图b）。然后作者又通过WB实验、ChIP测序发现，在METTL3D395A 细胞中，KDM3B与染色质的结合显著降低（图c，d，e）。随后，作者过表达了KDM3B从而减少了野生型细胞中的H3K9me2表达量，而在METTL3D395A 细胞中H3K9me2的表达量未发生明显变化（图f）。最后，作者在报告系统中进行了KDM3B ChIP qPCR实验，结果表明KDM3B与m6A报告基因的染色质区域有显著结合（图g）。以上实验结果一致证明，m6A在KDM3B靶向目标染色质从而引起H3K9me2去甲基化的过程中起到重要作用。

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5. YTHDC1通过招募KDM3B从而调控H3K9me2的表达

接下来，作者继续探究了KDM3B被招募至目标染色质上的过程是否与m6A的阅读蛋白相关。通过免疫共沉淀结果来看，在HEK293细胞和mES细胞中，KDM3B和YTHDC1均有相互作用（图a）。而敲低YTHDC1后，能够增加H3K9me2的表达水平（图b）。此外，作者还在敲低YTHDC1的细胞中进行了KDM3B ChIP-qPCR实验，实验结果显示，YTHDC1的敲低会使KDM3B与带m6A修饰的染色质区域结合减少（图c，d）。之后，作者使用dPspCas13b–YTHDC1融合蛋白，将其靶向至MALAT1、CEBPA 和FOS位点，发现KDM3B被招募到这些位点上，并且降低了H3K9me2的表达水平（图e，f，g）。由以上实验结果可知，YTHDC1能够招募KDM3B从而调控H3K9me2的表达。

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6. m6A影响H3K9me2导致的基因阻遏

H3K9me2通常会导致基因阻遏，而m6A可能在这个过程中发挥了重要作用。为了验证这一想法，作者做了qPCR等实验发现，在METTL3D395A细胞中，H3K9me2-up且带m6A修饰的基因与其他类型的基因（其他带或不带m6A修饰的基因）相比，其表达有显著降低（图a，b），并且，Pol II的表达水平也有显著下降（图c）。由此说明m6A能够影响H3K9me2导致的基因阻遏。

综上所述，m6A通过m6A阅读蛋白YTHDC1与KDM3B共转录靶向至目标染色质，从而促使H3K9me2的去甲基化，最终促进基因的表达（图d）。

在此插播一则好消息！！！

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